黃酮類化合物(Flavonoids)以其廣泛的藥理作用倍受青睞,而中藥材中總黃酮的含量測定成為近年來研究黃酮化合物所關(guān)注的焦點(diǎn)。中藥總黃酮的含量測定一般采用比色法、高效液相色譜法等。比色法是被5中國藥典6所采用的最常見的總黃酮測定方法,其中又以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法常用,在堿性條件下,利用其與黃酮物質(zhì)生成紅色鋁螯合物為特征,以蘆丁為對照,在510nm處測定吸光度,從而得到待測物質(zhì)總黃酮的含量,但是研究發(fā)現(xiàn)具有鄰二酚羥基的非黃酮類物質(zhì)在蘆丁顯色的最大波長處(510nm左右)也有較強(qiáng)吸收,而黃酮類成分黃芩素、山柰酚在此波長處沒有吸收,從而說明采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法,以蘆丁作為對照,不能排除非黃酮類物質(zhì)的干擾,這種方法測定中藥總黃酮含量的專屬性不強(qiáng)。因此,本實(shí)驗(yàn)采用另一種常用的比色法:三氯化鋁比色法,對幾類典型結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物(蘆丁、兒茶素、木犀草素、鼠李素、山柰奈酚、槲皮素、葛根素、金絲桃苷、橙皮苷)及多酚類化合物(2,3-二羥基苯甲酸,綠原酸,和厚樸酚,阿魏酸)三氯化鋁顯色前后的吸收峰(200~600nm)進(jìn)行比較,分析以蘆丁為對照品的三氯化鋁比色法測定中藥總黃酮的合理性,并對蘆丁顯色的pH值,三氯化鋁濃度、顯色溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化研究。

研究結(jié)果表明：

葛根素、蒙花苷、橙皮苷加入三氯化鋁，反應(yīng)前后紫外吸收峰的位置沒有發(fā)生改變，而其余物質(zhì)的紫外吸收峰均發(fā)生紅移。從結(jié)構(gòu)上分析，葛根素、蒙花苷、橙皮苷只存在5位羥基，不存在鄰二酚羥基和3位羥基，由此可見三氯化鋁的顯色反應(yīng)主要發(fā)生在3位羥基、4位羰基和鄰二酚羥基，只存在5位羥基、4位羰基時黃酮類物質(zhì)與三氯化鋁不發(fā)生反應(yīng)。

蘆丁與三氯化鋁發(fā)生顯色反應(yīng)，生成黃色絡(luò)合物，在421nm左右有較強(qiáng)吸收。實(shí)驗(yàn)對幾種常見的多酚類化合物紫外光譜圖進(jìn)行了掃描，結(jié)果表明對于含鄰二酚羥基的非黃酮化合物：2，3一二羥基苯甲酸、阿魏酸、和厚樸酚、綠原酸，三氯化鋁顯色前后在421nm左右均沒有吸收峰，消除了非黃酮類化合物對顯色的干擾。

槲皮素為蘆丁的苷元，顯色后在437nm左右有較大吸收，而蘆丁的最大吸收峰在421nm，說明黃酮的苷和苷元的極性相差較大，槲度素3位羥基可能對反應(yīng)有影響。木犀草素的結(jié)構(gòu)和蘆丁相比，3位沒有羥基，顯色后在414nm有最大吸收，從而進(jìn)一步說明3住羥基可能對三氯化鋁顯色反應(yīng)有影響

具有典型結(jié)構(gòu)的常見的黃酮類苷和苷元：金絲桃苷，蘆丁，異鼠李素，山柰奈酚，三氯化鋁顯色前在421nm處無吸收，顯色后均在蘆丁的最大吸收峰421nm左右有較大的吸收。在現(xiàn)今的實(shí)驗(yàn)條件下，對于大多數(shù)黃酮類中藥材而言，多含有黃酮苷，常見的苷在此波長處有較強(qiáng)吸收，而非黃酮類物質(zhì)在此處無吸收。因此以蘆丁作為對照，三氯化鋁比色法可以成為測定中藥總黃酮含量的理想方法。

對于任一絡(luò)合反應(yīng)，溶液的酸堿度會影響金屬離子的水解及存在形式，影響絡(luò)合物的組成。當(dāng)采用鹽酸（氫氧化鈉）調(diào)節(jié)顯色溶液pH值時，因其酸（堿）性較強(qiáng)，破壞絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)，無法測得中藥總黃酮含量的真實(shí)值，而采用NaAc-HAc緩沖鹽溶液時，加入前后蘆丁的吸收峰位置不變，仍在359nm處，所以采用NaAc-HAc緩沖鹽調(diào)節(jié)顯色溶液的pH值。

從方法的可行性考察結(jié)果可以看出，以金絲桃苷為樣品，采用2種方法考察回收率，優(yōu)化的方法準(zhǔn)確度更高，所以加入O.1mol／L三氯化鋁，pH為5.2的NaAc-HAc緩沖溶液，40℃水浴加熱1Omin為三氯化鋁比色法的優(yōu)化顯色條件。