摘 要： 目的探究電針對三氯化鋁致擬阿爾茨海默病(AD)模型小鼠學習記憶障礙的保護作用。方法將40只健康成年小鼠按隨機數表法隨機分為對照組、模型組、針刺組、電針組,每組10只。除對照組外,其余組給予三氯化鋁(60 mg/kg),連續7d,導致小鼠擬AD模型后,對各組小鼠進行避暗試驗,測定其治療前潛伏期和錯誤次數。針刺組針刺百會和大椎穴,電針組電刺激百會和大椎穴,7 d后再次測定各組小鼠治療后的潛伏期與錯誤次數,并取腦測定腦重系數。通過觀察治療前后各組的潛伏期、錯誤次數和小鼠腦重系數等指標。結果 治療前模型組、針刺組及電針組潛伏期較對照組顯著縮短(P<0.01);錯誤次數較對照組明顯增加(P<0.05)。治療后潛伏期針刺組、電針組較模型組明顯延長(P<0.05),電針組與針刺組相比,潛伏期有所延長,但差異無顯著性(P>0.05);錯誤次數電針組較模型組顯著減少(P<0.05),電針組與針刺組、針刺組與模型組相比,錯誤次數均有所減少,但無顯著差異。腦重系數模型組較對照組顯著降低(P<0.01),針刺與電針組與模型組相比,腦重系數明顯增加(P<0.05),電針組較針刺組腦重系數有增加趨勢,但兩者比較無顯著差異。結論 電針與針刺均能對小鼠學習記憶障礙發揮保護作用,電針的作用優于針刺。

研究發現,鋁可以在腦組織中蓄積,干擾腦組織活動,破壞神經元結構,從而導致中樞神經功能障礙。故很多藥物治療阿爾茨海默病(AD)的研究常以三氯化鋁模擬AD動物模型。鋁可增強腦組織中脂質過氧化水平,引發炎癥反應,促進腦細胞凋亡,使腦神經細胞受到損傷,進而使擬AD模型動物出現學習記憶障礙。電針具有針刺和電刺激的雙重治療作用,不但具有針刺的效果,還具有抗炎、抗氧化、改善血液循環、抑制細胞凋亡,提高組織對自由基的抵抗能力等作用,從而可能對擬AD動物模型學習記憶能力起到保護作用。本研究觀察電針對于三氯化鋁致AD小鼠學習記憶障礙的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

選用健康成年小鼠40只,體重25~30g,不計雌雄,由四川大學實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(川)-10-2006。并將40只小鼠按隨機數表法分為四組:對照組、模型組、針刺組、電針組,每組10只。

1.2 試劑和儀器

結晶氯化鋁:成都科龍化工試劑廠,批號:20040602;氯化鈉注射液:安徽雙鶴藥業有限責任公司,批號:1101202E。華佗牌SDZ-Ⅳ型電針治療儀:蘇州醫療用品廠有限公司;BA-200自動避暗測試儀:成都泰盟科技有限公司;華佗牌無菌針灸針:蘇州醫療用品廠有限公司;上皿電子天平:上海精科電子天平儀器廠。

1.3 模型的制備及治療措施

將四組小鼠按隨機數表編號后分籠飼養,模型組、針刺組、電針組按60mg/kg的量給予三氯化鋁皮下注射,對照組等體積給予生理鹽水皮下注射,1次/d,連續7d。造模完成后,將四組小鼠同時固定于小鼠板上,對照組和模型組不給予治療措施,針刺組和電針組小鼠取“百會”(小鼠頭部正中兩耳間,平刺2mm)、“大椎”(第7頸椎棘突下,向下直刺4mm)二穴,針刺組刺入后留針15min拔出;電針組刺入后給予疏密波治療,百會接正極,大椎接負極,持續時間15min,頻率4/20 Hz,電流0.5~1mA,以背部肌肉出現輕微抽動及尾巴擺動為度,連續電針7d,每天固定時間電針1次。電針完畢后將各組小鼠同時從小鼠板上取下,放入清潔籠具中飼養,治療期間各組小鼠自由進食、飲水,每天更換墊料,并保證飼養環境適宜的溫度、濕度,適當通風,避免飼養不當而導致實驗動物死亡。

1.4 指標檢測

1.4.1 避暗測試

采用BA-200自動避暗測試儀測試,反射箱分大小相等的6個箱,造模結束后,將四組小鼠在反射箱中先訓練3min,間隔24h后對各組小鼠進行治療前避暗測試;治療完畢后,采用同樣的方法對各組小鼠進行治療后避暗測試。具體方法為在反射箱通電的情況下,將小鼠放入明室,記錄小鼠第一次從明室進入暗室的時間,稱為潛伏期(LT);小鼠受電擊后逃避性地跑出暗室,其次數稱為錯誤次數(EN),觀察并記錄潛伏期及5min內小鼠的錯誤次數。

1.4.2 腦重系數測定

治療后避暗試驗測試完畢,稱量并記錄小鼠體重,然后將小鼠斷頭處死,迅速取下腦橋基底部上緣水平以上的全部腦組織,除去多余組織后,立即用生理鹽水沖洗血液及黏附組織,再用濾紙拭去多余的水分,立即稱量并記錄腦濕重,按以下公式計算腦重系數:腦重系數=腦濕重(g)/體重(g)×100%。

1.5 統計學方法

采用SPSS17.0軟件進行SNK法(q檢驗)。

2 結果

2.1 小鼠基本狀況

造模后各組小鼠自由進食、飲水,模型組小鼠多表現為動作不靈活,身體蜷縮,被毛光澤度降低,并可見豎毛,且進食較正常小鼠減少。對照組精神狀態良好,進食、飲水正常,動作靈活,反應靈敏,少有蜷縮。電針組和針刺治療后,電針組和針刺組小鼠精神狀況較模型組有較明顯的改善,被毛光澤度提高,蜷縮者較模型組明顯減少。在電針和針刺過程中,可能由于人為操作不當和個別小鼠對針刺和電針不可耐受等原因,導致電針組小鼠死亡1只,針刺組小鼠死亡2只,其余組無小鼠死亡,總死亡率為7.5%。之后及時補充同批次實驗動物,使每組實驗動物在數量上保持一致。

2.2 小鼠避暗試驗結果

治療前模型組、針刺組及電針組LT較對照組顯著縮短(P<0.01);模型組、針刺組及電針組組EN較對照組明顯增加(P<0.05),針刺與電針組間無顯著差異(P>0.05)。表明Al Cl3致小鼠學習記憶障礙模型復制成功,見表1。治療后針刺組與電針組LT相比于模型組明顯延長(P<0.05),電針組與針刺組相比,治療后LT有所延長,但兩者比較無顯著差異(P>0.05);治療后電針組EN較針刺組顯著減少(P<0.05),電針組與模型組、電針組與針刺組相比,EN均有所減少,但兩兩間比較無顯著差異,說明電針組對于Al Cl3致學習記憶障礙的保護作用明顯優于針刺組。見表1。

2.3 小鼠腦重系數測試結果

與模型組(0.014 3±0.0009)比較,對照組、針刺組及電針組腦重系數顯著增高(0.017 6±0.001 3,0.016 3±0.002 4,0.016 8±0.000 9,P<0.05),其余各組間比較無顯著差異(P>0.05)。電針組相對于針刺組腦重系數有所增加,但兩者比較無顯著差異(P>0.05)。

表1 各組小鼠治療前后避暗試驗LT及EN比較(±s,n=10)

3 討論

研究證實,鋁加強腦組織中的脂質過氧化反應是鋁產生慢性神經毒性作用的主要機制之一,鋁可以引起腦組織中自由基的大量產生,從而引發炎癥反應而致神經元喪失和認知功能障礙。而且,研究發現,在AD患者腦組織中,氧化性損傷廣泛存在,慢性鋁接觸可誘導、甚至加重AD的氧化性損害。有研究顯示,鋁可直接損傷記憶的生理基礎———突觸可塑性,從而導致動物出現學習記憶功能障礙。劉永琦等研究發現,老年癡呆病人腦重系數較正常人減少,大腦萎縮,腦體積縮小。而鋁在血液中主要與轉鐵蛋白、白蛋白和IgG結合形成復合,沉淀于血液和血管壁,造成免疫異常、血管和血腦屏障損害,使AD患者腦血流供應量減少。雖然有較多關于AD機制的研究,但是,至今AD的具體發病機制仍不太清楚。

電針具有抗氧化、抵抗自由基、改善血液循環、降低Ca含量、保護損傷神經、保護損傷腦組織和抑制細胞凋亡等作用;而且電針同時具有針刺的功效,中醫認為,AD病位在腦,辨證以腎精不足,髓海空虛為本,痰瘀蒙蔽清竅為標,強調補腎活血以治其本,醒神開竅以治其標。研究證實,針刺治療AD確有補腎活血、醒神開竅的作用,標本同治,盡早緩解AD癥狀,有助于提高AD患者生存質量。據《靈柩·海論》記載,百會穴為督脈和足太陽膀胱經的交會穴,具有醒神開竅之功效,為治療老年性癡呆的主要穴位,經臨床研究證實,針刺此穴對于本病可能出現的精神、神志異常均有一定的療效;根據《素問·氣府》描述,大椎位于第7頸椎棘突下,屬督脈經穴位,是手足六陽經的交會穴,故稱之為“諸陽之會”,針刺此穴可通調諸經,具有增強各臟腑經絡之功效,亦可促使陰陽平衡。

本研究結果顯示電針對AD小鼠學習記憶障礙的保護作用明顯優于針刺,其原因可能與電針能更有效地抵抗自由基,防止脂質過氧化作用,抑制腦組織神經細胞凋亡,保護神經元功能,減輕腦萎縮有關,從而對擬AD模型小鼠的學習記憶能力起到保護作用。

參考文獻

[1] Rondeau V,Commenges D,Jacqmin-Gadda H,et al.Relation between aluminum concentrations in drinking water and Alzheimer's disease:an 8-year follow-up study〔J〕.Am J Epidemiol,2000;152(1):59-66.

[2] Hollosi M,Urge L,Perczel A,et al.Metalion-induced conformation changes of phosphrylated fragments of human neurofilament protein〔J〕.J Moliol,1992;223(6):673-82.

[3] Newman PE.Alzheimer's disease revisited〔J〕.Med Hypotheses,2000;54(5):774-6.

[4] Yokel RA.Aluminum produces age related behavioral toxicity in the rabbit〔J〕.Neurotoxicol Teratol,1989;11(3):327-42.

[5] 袁晉峰,潘寶龍.三氯化鋁對小鼠認知功能的影響〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜志,2010;8(11):1354-5.

[6] 劉永琦,何建成,安耀榮,等.扶元補腦沖劑對老年性癡呆ATP酶及脂質過氧化反應的影響〔J〕.中成藥,2004;26(2):130-3.

[7] 楊榮,夏保蘆.鋁對學習記憶的抑制作用及其機理〔J〕.江漢大學學報(自然科學版),2005;33(2):81-6.

[8] Campbell A.The potential role of aluminium in Alzheimer's disease〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2002;17(Suppl2):17-20.

[9] 孫石磊,馬光瑜,繪小龍.納洛酮對鋁致學習記憶減退大鼠學習記憶的影響〔J〕.中國行為醫學科學雜志,2003;12(6):607-8.

[10] 鄧娜,高敏.電針治療脊髓損傷的基礎理論研究〔J〕.甘肅中醫,2009;22(3):11-2.

[11] 李志剛,劉如春,耿直,等.電針對急性脊髓損傷大鼠差異表達基因及鈣離子作用的實驗研究〔J〕.北京中醫藥大學學報,2008;31(7):486-9.

[12] 張迪,孫麗英.電針“百會風府”穴對學習記憶障礙大鼠細胞凋亡的影響〔J〕.遼寧中醫雜志,2007;34(7):1006-7.

[13] 張衛,劉來虎.針灸對老年癡呆模型小鼠防治作用的實驗研究〔J〕.陜西中醫,2001;22(10):633-4.

[14] 蔣希成,姜國華,于洋.針刺對老年癡呆大鼠行為學改變的影響〔J〕.中國中醫藥科技,2009;16(3):155-6.

作者簡介：楊拯(1980-),男,碩士,副研究員,主要從事老病及學習記憶障礙相關疾病研究。

作者簡介：王政(1992-),男,主要從事老年病及學習記憶障礙研究。